Пробиотик Субтилис является инновационным микробиологическим продуктом с высоким, до 98%, содержанием спор, способным выдерживать баро и термообработку, свойственную технологии изготовления экструдированных и гранулированных кормов. Поэтому традиционные методики, применяемые в баклабораториях для определения вегетативных форм микроорганизмов (т.н. общая обсемененность) являются в этом случае непригодными. В этой связи необходимо предусмотреть выполнение целого ряда специфических мер, в частности, термоактивацию спор, увеличение срока выращивания культуры (минимум 5 суток), применение специальных прописей питательных сред и т.д. Технические условия на Субтилис ТУ 9191-012-13571419-06 зарегистрированы в ФГУ «Ростест-Москва» и внесены в Государственный реестр под.№ 200/071481 от 25.04.06. Методика определения активности Субтилиса разработана производителем Субтилиса - «НИИ Пробиотиков» совместно с учеными Института биохимии и физиологии микроорганизмов Российской Академии наук им Г. К. Скрябина. Методика прошла успешную апробацию в ряде ведущих лабораторий России, и в том числе, в Центральной научно-методической ветеринарной лаборатории Департамента ветеринарии РФ (п.г.т. Косино, Московской области), в Федеральном Государственном агрохимическом центре МСХ РФ (п.г.т. Немчиновка, Московской области). Аналоги Субтилиса - субалин, ветом, ветосубалин - содержат в основном вегетативные формы микроорганизмов с незначительным содержанием спор (до 5%), и определение их активности (наличия вегетативных клеток) не вызывает трудностей у специалистов. Нами были проведены исследования по определению способности микроорганизмов, содержащихся в различных пробиотических препаратах к росту при различной температуре с использованием авторизированной питательной среды. Исследовали два образца лечебного пробиотического препарата «Субалин»: №1 и №2 (производитель не известен), препарат «Субтилис» (производитель НИИ Пробиотиков) и препарат «Ветом 1.1» , произведенный ООО НПФ «Исследовательский центр» (Новосибирская обл., п. Кольцово). В качестве ростовой среды использовали LB агар. Чашки с культурами инкубировали при температуре +30°С, +20°С, +8°С. Результаты исследований представлены в таблице 1.
Препарат
Условия культивирования (среда, температура, время)
LB агар +30°С 48 часов
LB агар +20°С 48 часов
LB агар +8°С 7 суток
LB агар + Km50 30°С 48 часов
Субтилис
3 ´ 109 КОЕ/г
2,8 ´ 109 КОЕ/г
1,3 ´ 109 КОЕ/г
2,5 ´ 106 КОЕ/г
Субалин I
4 ´ 107 КОЕ/г
3,6 ´ 107 КОЕ/г
нет роста
2,5 ´ 105 КОЕ/г
Субалин II
7 ´ 105 КОЕ/г
6,7 ´ 105КОЕ/г
нет роста
2,2 ´ 105 КОЕ/г
Ветом 1.1
5 ´ 106 КОЕ/г
5 ´ 106 КОЕ/г
нет роста
1 ´ 106 КОЕ/г
При инкубировании культур при +30°С и +20°С уже через 48 часов наблюдался рост микроорганизмов. Концентрации микроорганизмов сопостовимы, однако при +20°С колонии микроорганизмов меньше в размере, чем таковые при +30°С. При температуре +8°С растут только микроорганизмы, содержащиеся в препарате «Субтилис» (Таб.1). Препараты «Субалин» образец I и образец II и «Ветом 1.1» содержат микроорганизмы, имеющие плазмидную ДНК, которая содержит ген a2 интерферона человека, т.е. генно-модифицированные организмы (ГМО). Также проводился анализ представленных образцов на наличие в клетках культур плазмидной ДНК. Выделение плазмидной ДНК проводилось с использованием методики щелочного лизиса с некоторыми модификациями. Буферные растворы использовали в 15-кратном объеме, в котором клетки выдерживали в течение 15 минут при комнатной температуре. Визуализация плазмидной ДНК осуществлялась с использованием электрофореза в 0,8% агарозном геле. Показано наличие плазмидной ДНК во всех 3 исследуемых образцах.
Известно, что в составе плазмиды наряду с геном a2 интерферона человека имеется ген резистентности к высоким концентрациям канамицина (Km). Поэтому, чтобы определить процентное соотношение плазмидосодержащих клеток по отношению к общему количеству клеток, входящих в состав указанных препаратов, раствор исследуемых образцов после соответствующих разведений высевали на селективные агаризованные среды, содержащие канамицин в концентрации 50 мкг/ мл. Чашки с культурами микроорганизмов инкубировали при +30° С в течение 48 часов. Данные представлены в Табл.1,столбец 5. Полученные результаты позволяют сделать следующее заключение: препарат «Субалин» образец I, содержит более 1% плазмидосодержащих клеток (ГМО), препарат «Субалин» образец II — 30% (ГМО), препарат «Ветом 1.1» — 20% (ГМО). Препарат «Субтилис», содержит менее 0,07% канамицинустойчивых клеток.
В постановлении № 149 Главного Государственного Санитарного врача РФ «О проведении микробиологической и молекулярно-генетической экспертизы генетически модифицированных микроорганизмов, используемых в производстве пищевых продуктов» от 16 сентября 2003 г. сказано следующее:
1. Ввести в гигиеническую характеристику продукции, подлежащей санитарно-эпидемиологической экспертизе в ГУ НИИ питания РАМН, микробиологическую и молекулярно-генетическую экспертизу генетически модифицированных микроорганизмов.
2. Возложить на ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН обязанности по проведению микробиологической и молекулярно-генетической экспертизы пищевой продукции, полученной с использованием генетически модифицированных микроорганизмов, в том числе пробиотиков.
3. Утвердить: … перечень продукции, полученной с использованием генетически модифицированных микроорганизмов, подлежащих санитарно–эпидемиологической экспертизе ….
Следовательно, ветом и его модификации, являющиеся ГМО (субалин, ветосубалин), попадают под эту категорию, что необходимо учесть производителям пищевой рыбной продукции, которые вводят в корма для рыб эти препараты.
Вообще мы считаем, что руководители рыбохозяйственных предприятий при назначении лечебных препаратов, должны придерживаться следующих правил:
Разрешено ли применять ГМО-препараты при производстве пищевой рыбной продукции?
Кому принадлежат права собственности на данный микробиологический продукт?
Какие штаммы микроорганизмов являются действующим началом и являются ли они вообще пробиотическими?
Зарегистрированы ли штаммы в Российской национальной коллекции микроорганизмов?
Есть ли патенты Российской Федерации на штаммы спорообразующего пробиотика и сертификаты соответствия? Имеются ли ветеринарные наставления, утвержденные Департаментом ветеринарии МСХ РФ и насколько их содержимое соответствует ответам на предыдущие вопросы?
Кто является производителем продукции, лицензия и где его изготавливают, наличие ТУ на производство, адрес, телефон, ФИО руководителя?
Каков уровень дополнительных информационных материалов (проспектов, отчетов, методических материалов, публикаций) и какие коллективы микробиологов участвуют в научно-техническом сопровождении?
Где производились испытания, внедрение и их достоверность
Для импортных препаратов – таможенные документы
Сертификаты соответствия? Все материалы должны быть предоставлены в оригинале или быть заверенными оригинальной печатью продавца товара.
Среди имеющихся на Российском рынке пробиотических препаратов только пробиотик «Субтилис» отвечает всем вышеперечисленным требованиям.
